Технология редактирования ДНК CRISPR-Cas пока слишком опасна для использования на геноме человека
Генетики увидели, как раскручивается ДНК и поняли, что в процессе слишком велики тепловые колебания. Это показало, почему «молекулярные ножницы» не работают как надо: они колеблются. А значит пока CRISPR-технологии редактирования ДНК применять для внесения изменений в геном эмбриона человека нельзя. Доктор Хэ поторопился.
Когда бактерии подвергаются атаке вируса, они могут защитить себя с помощью механизма, который защищает их от генетического материала нарушителем. Ключом к нему являются белковые комплексы CRISPR-Cas. Только в последнее десятилетие была открыта и выяснена их функция в адаптивном иммунитете микроорганизмов.
С помощью встроенной РНК комплексы CRISPR распознают короткую последовательность в ДНК нарушителя. Механизм распознавания последовательности РНК сегодня используется для избирательного выключения и модификации генов в любых организмах. Это открытие произвело революцию в генной инженерии и уже в 2020 году было отмечено Нобелевской премией по химии, присужденной Эммануэль Шарпантье и Дженнифер А. Дудна.
Однако иногда CRISPR-комплексы реагируют и на сегменты генов, которые незначительно отличаются от последовательности, заданной РНК. Это приводит к нежелательным побочным эффектам в медицинских приложениях: «молекулярные ножницы» (белок Cas9) в таком случае может ошибиться и отрезать не тот фрагмент, который нужен. Риск настолько большой, что использование CRISPR-технологии сегодня ограничено, фактически генной инженерией растений. «Причины этого пока не вполне понятны, поскольку до сих пор этот процесс не удавалось наблюдать напрямую», — говорит Доминик Кауэрт, соавтор работы.
Как увидеть каждый нуклеотид
Чтобы лучше понять процесс распознавания и наконец выяснить почему РНК (так называемая гидовая РНК) ошибается, команда под руководством профессора Ральфа Зайделя и Доминика Кауэрта из Университета Лейпцига воспользовалась тем фактом, что двойная спираль ДНК, которую нужно отредактировать, раскручивается во время распознавания, чтобы обеспечить сопряжение оснований с РНК. После этого двойная спираль представляет собой два параллельных одинарных участка. А сам процесс раскручивания имеет определенную механическую силу и может воздействовать на другие микрообъекты.
«Главный вопрос проекта заключался в том, можно ли вообще увидеть раскручивание участка ДНК длиной всего 10 нанометров в реальном времени», — говорит Кауэрт.
Для детального наблюдения за процессом раскручивания ученые должны были сделать его видимым для микроскопа. Для достижения этой цели команда использовала достижения ДНК-нанотехнологии, с помощью которой можно создать любую трехмерную ДНК-наноструктуру.
Используя так называемую технику ДНК-оригами, исследователи сконструировали роторный рукав ДНК длиной 75 нм, к концу которого была прикреплена золотая наночастица. В эксперименте сила вращения последовательности ДНК толщиной 2 нм и длиной 10 нм передавалась золотой наночастице диаметром 160 нм. Наночастица золота начинала вращаться, а это движение уже можно было отследить с помощью микроскопа.
С помощью этого метода исследователи наблюдали распознавание фрагмента целевой ДНК комплексом CRISPR практически пара за парой оснований. Оказалось, что сопряжение оснований целевой ДНК с гидовой РНК нестабильно. И весь комплекс CRISPR нестабильно связан с целевой ДНК во время распознавания последовательности. Как будто гидовая РНК «видит» целевой фрагмент нечетко.
После распознавания всей последовательности происходит стабильное связывание и последующее «перекусывание» ДНК «молекулярными ножницами». Если РНК не может распознать фрагмент, то процесс прерывается. Это малая беда, хуже если РНК приклеится комплиментарной связью не к тому фрагменту, который нужен. А вот это уже может привести к настоящей катастрофе, особенно если речь идет о редактировании эмбриональной ДНК.
Открытие поможет правильно подбирать гидовые РНК
То, что процесс распознавания иногда дает неверные результаты, объясняется его стохастической природой, т.е. случайными движениями молекул, что и удалось продемонстрировать исследователям. «Распознавание последовательностей происходит под действием тепловых флуктуаций при сопряжении оснований», — говорит Кауэрт.
С помощью полученных данных удалось создать термодинамическую модель распознавания последовательностей, которая описывает распознавание колеблющихся сегментов гидовой РНК и целевой ДНК. В будущем это позволит лучше подбирать последовательности РНК, которые распознают только нужную последовательность-мишень, оптимизируя тем самым точность генетических манипуляций.
Поскольку разработанные нанороторы универсальны по своей пригодности для измерения крутящих моментов в одиночных молекулах, они могут быть использованы и для других комплексов CRISPR-Cas или биомолекул.
Результат говорит о том, что сегодняшние ограничения на использование CRISPR совершенно оправданы. Потому что получается, что «молекулярные ножницы» работают не «так как надо», а «примерно так как надо». И значит редактировать, например, ДНК эмбриона человека таким инструментом слишком рискованно.