Команда генетиков под руководством Института Брода Гарвардского университета разработала инновационный инструмент для редактирования генома. Описанный в журнале Science метод может проложить путь к генокорректирующим терапиям, которые будут назначаться один раз и работать независимо от конкретной мутации, вызывающей болезнь человека. Кроме того, он может ускорить разработку клеточных методов лечения рака и упростить создание генетических моделей для исследований.
Новый инструмент может точно вставлять в человеческую ДНК целые гены
Команда генетиков под руководством Института Брода Гарвардского университета разработала инновационный инструмент для редактирования генома. Инструмент может точно и эффективно вставлять целые гены в человеческую ДНК.
Система, которая может добавить целый ген в геном, использует ферменты, называемые транспозазами (желтый, синий, фиолетовый; иллюстрация художника), для изменения ДНК (красный, зеленый). Laguna Design/Science Photo Library
Несколько лет назад после открытия технологии CRISPR появилась реальная возможность редактирования генома человека. Но пока все технологии такого типа делают ошибки и работают только с короткими фрагментами ДНК. Поэтому появление принципиально новых идей, в том числе для лечения наследственных заболеваний, так важно.
«Это может стать важной частью будущего», — говорит соавтор исследования Дэвид Лю, биолог из Института Броуда в Кембридже, штат Массачусетс.
Транспозазы
Схема передвижения транспозонов I. ДНК-транспозоны: способ передвижения «вырезать и вставить». II. ДДП-1-ретротранспозоны: способ передвижения «копировать и вставить».
Один из наиболее распространенных методов доставки генов основан на использовании сконструированных вирусов для вставки участков генетического материала в геном клетки. Несмотря на свою эффективность, эти вирусы, как правило, вставляют свою полезную нагрузку в случайном порядке, что чревато опасными нарушениями или слабым контролем над экспрессией генов.
CRISPR обеспечивает более точный контроль, чем вирусные носители, но обычно требует разрезания ДНК, что повышает вероятность нежелательных мутаций и неполного восстановления, или разработки индивидуальных шаблонов для каждой мутации, что ограничивает возможности его масштабирования.
Новая система позволяет обойти обе проблемы, внедряя полноразмерные гены в целевые участки за один шаг, не разрезая ДНК и не прибегая к индивидуальному проектированию. Метод, разработанный Лю, биохимиком Сэмюэлем Штернбергом из Колумбийского университета в Нью-Йорке и их коллегами, использует комплекс бактериальных ферментов под названием CRISPR-ассоциированная транспозаза, или CAST.
Транспозазы — это ферменты, обеспечивающие перемещение «прыгающих генов» — «эгоистичных» участков ДНК, которые перемещаются по геному, чтобы себя распространить. Исследователи уже использовали системы CAST для перемещения больших фрагментов генетического материала в бактериальных клетках. Но в клетках человека и других млекопитающих все ранее описанные версии CAST работали с низкой эффективностью.
Эволюционирующие ферменты
Эволюционировавшие в PACE CASTs обеспечивают эффективную, программируемую интеграцию генов в клетках человека.
CASTs используют нуклеазно-дефицитную систему CRISPR-Cas для рекрутирования транспозазного комплекса, катализирующего интеграцию ДНК (вверху слева). Ученые разработали PACE-селекцию, которая связывает интеграцию с распространением фага, кодирующего компоненты транспозазы (вверху справа), в результате чего был создан эволюционировавший CAST, который поддерживает>200-кратное улучшение интеграции в клетках человека (внизу слева). EvoCAST обеспечивает эффективную и целенаправленную интеграцию терапевтически значимых генов во многих геномных локусах (внизу справа), открывая путь к мутационно-диагностической терапии генетических заболеваний с потерей функции.
Чтобы преодолеть эти препятствия, Лю и Штернберг обратились к направленной эволюции — методу, позволяющему использовать силу дарвиновского отбора в лабораторных условиях. Они поместили ключевые гены, кодирующие компоненты системы CAST, в бактериофаг — вирус, заражающий бактерии. При этом вирусы с наиболее эффективными версиями CAST — теми, которые быстро и точно интегрируют ДНК в геном, — росли лучше всего. Затем они позволили эволюции идти своим чередом.
После сотен поколений вирусов и рациональной инженерии некоторых компонентов CAST исследователи получили оптимизированную версию ферментного комплекса. Он содержал 21 небольшое изменение в пяти белках, составляющих архитектуру CAST, — достижение, которое раздвигает границы дизайна белков, отмечает Макото Сайто, биоинженер из RIKEN в Вако, Япония. «Это сумасшедшая направленная эволюция!», — говорит он.
Полученный комплекс, названный evoCAST, продемонстрировал эффективность вставки до 30% в нескольких геномных участках — более чем 400-кратное улучшение по сравнению с неэволюционировавшим оригиналом.
В лабораторных испытаниях evoCAST успешно интегрировал сегменты длиной более 10 000 нуклеотидов, достаточные для доставки целых генов и их управляющих элементов. Технология работала в различных типах человеческих клеток, нацеливаясь на геномные «безопасные гавани», способные принять новую ДНК без нарушения клеточных функций, и устанавливая генетическую полезную нагрузку в естественные места расположения нескольких генов, связанных с заболеваниями.
Примечательно, что evoCAST доставляет свой генетический груз за один ферментативный шаг, не создавая двухцепочечных разрывов в геноме.
Разработка evoCAST и поиск других систем на основе транспозонов говорит о том, что эта область только начинает раскрывать потенциал подобных систем для безопасной установки больших генетических нагрузок там, где они больше всего нужны, говорят ученые. «В этом и заключается красота инженерии», — говорит Стернберг. — «Мы всегда можем сделать так, чтобы это работало лучше».